经典的蛋白药物代谢分析采用配体结合实 验（ligand-binding assay，lba)技术，其中以 酶联免疫吸附实验法 (enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)为代表，该技术 对设备要求低，易于操作，灵敏度高。但 elisa方法存在一些缺陷，如：受自身抗体干 扰、定量范围窄、非特异性结合、交叉反应、 以及免疫原性影响等问题。近年来备受关注 的串联质谱方法（lc-ms/ms），在进行蛋白 药物代谢分析中，可提供卓越的选择性，良 好的准确性、精确性、以及宽定量范围，并 具有开发时间短（约几周时间），分析通量 高与多重分析能力的特性。因此，串联质谱 法在蛋白药物代谢分析中的应用日渐增多， 并已经形成了系统的分析方案，可见综述论 文[1,2] 。
蛋白类药物代谢定量液质分析流程如图一。 通常情况下，起始样品量为几至几百微升血 液，分析需经过1）蛋白纯化，2）酶解，3） 多肽纯化，4）色谱分离，5）质谱检测以及6） 内标添加等步骤。在实验中，直接的分析目 标并不是完整的蛋白药物本身，而是它的部 分片段——多肽。受到液质分析能力限制，分 子量大于4-5kda的蛋白药物需要被处理到肽段 水平，并在酶解产生的众多肽段中，选择序 列独特，可特异性代表蛋白药物的肽段——指 纹肽（signature peptide，sp）作为直接分析 对象(多肽类药物采用可直接分析的方法[3,4] )。 因此在蛋白药物代谢液质分析中，实际是对 指纹肽的确认与定量，也就是说通过指纹肽 代表蛋白进行分析。
与小分子药物代谢质谱分析相同，对指纹 肽的精确定量，需要相应的内标进行参照。 在解析质谱数据时，通过比较掺入的内标肽 与蛋白本身的指纹肽相对量，并与事先建立 好的标准定量曲线对照，完成定量。内标肽 是被选为指纹肽的稳定同位素标记形式 （stable isotope labeled, sil-），内标肽与其 对应的指纹肽具有相同氨基酸序列，除质量 差别外，两者具有相同的色谱与质谱行为。 此方法被称为同位素稀释-选择/平行反应监测 质谱法(stable isotope dilution - select/parallel reaction monitoring ms, sid-srm/prm-ms) [5,6]
有三种内标肽添加方法：第一种是在初始 样品中直接添加同位素标记的蛋白形式的内 标（sil-standard protein）；第二种是在蛋白 纯化后，加入含有序列长度略长于指纹肽的 同位素标记的内标肽（sil-winged standard peptide）;第三种是在样品酶解后，加入与指 纹肽序列相同的同位素标记的内标肽（simple sil-standard peptide）。显而易见，内标加入 的越早，其与目标蛋白共同经历的处理步骤 越多，各种操作造成的影响越一致，最终的 定量准确度与重现性越好。第三种simple silstandard peptide是根据参照指纹肽序列合成 的，其差别仅在于内标肽含稳定同位素（一 般使用c13、n15等重稳定同位素）。添加这 种内标肽的成本最低，但其实验准确性较差。 对于sil-winged standard peptide形式的内标肽 而言，除标记同位素外，其氨基酸序列较相 应的指纹肽延长了n及c端。这样延长的silwinged standard peptide 就可以参与到酶切步
骤，因此其实验可靠性优于简单稳定同位素 内标。由于实验中往往需要至少2个以上的内 标肽，因此多个内标肽可以连续的方式合成， 形成首尾相接的形式（concatenated standard peptide），可在一定程度上降低成本。在这 三种内标中 ， 因 为 silstandard protein将会与目标蛋白经历完全相同 的处理过程，因此可以获得好的准确性与 重现性。
确定指纹肽是整个分析流程的基础，关键 的选择因素包括：1）特异性，2）酶切过程 中产生速度及重现性，3）在整个操作过程中 的化学稳定性，4）色谱中可保留，5）质谱 离子化效率高，质谱碎片质量好。指纹肽的 选择流程见图二。
在确定指纹肽的特异性时，可使用的软件 及数据库工具有： peptideatlas 、 skyline 、 blast。由于指纹肽需要在全过程保持稳定， 因此，除序列特异性外，还需要对其氨基酸 组成进行选择，如不能含有不稳定氨基酸残 基及序列 ， 如 ： methionine 、 cystine 、 tryptophan，相邻的 aspartic acid 与 glycine， 在n端的 glutamine 或 asparagine 等。为避免 trypsin漏切，碱性氨基酸相连的情况，如argarg、arg-lys、lys-lys，也要被排除。指纹肽 的长度在8-15个氨基酸残基比较合适，序列太 短难于在色谱上保留，而序列太长可能会有 成本及质谱碎裂质量问题。此外，由于proline 残基可以促进产生强的碎片信号，因此优先 选择含有proline的肽段。有一些软件工具可以 帮助选择指纹肽，但诸如色谱共洗脱离子抑制，酶切效率等方面的考察，仍必须通过实 验来进行最终确认。指纹肽的数量需要达到2- 3个以满足蛋白药质谱确证及定量。对于单抗 产品来说，由于其与内源性免疫球蛋白的高 度的序列同源性，有时非常难于选出多个特 异的指纹肽。对于只可选出一个指纹肽的样 品来说，可主要使用这个指纹肽进行确认及 定量，而其它不能满足全部要求的候选指纹 肽也可保留1-2个，作为辅助信息。
除选择指纹肽、添加内标策略选择等环节 外，蛋白纯化、酶切条件优化、肽段纯化、 液相分离与质谱分析各个环节都对最终结果 的灵敏度、重现性有着重要的影响。蛋白纯 化步骤可减少基质干扰，提高目标蛋白相对 浓度。在这一步可选择技术包括：分子量过 滤，蛋白沉淀（protein precipitation, pp）、固相萃取（solid-phase extraction, spe），白蛋白 去除，以及针对含有igg的fc片段蛋白药物的 protein a亲和富集。目前在酶切时，大多使用 胰蛋白酶（trypsin），其主要步骤包括蛋白的 变性、还原、烷基化、酶切等。需要优化的 条件包括酶切缓冲溶液，酶切时间等。多肽 富集步骤可以进一步提高指纹肽浓度，有利 于实验灵敏度的提高。在蛋白药代谢液质分 析中，可选择的色谱方式包括conventional （色谱柱内径大于1毫米），capillary（色谱 柱内径介于0.1至1毫米），以及nano lc（纳 升液相，色谱柱内径小于0.1毫米）三种。其 中色谱柱内径越大，数据的精确度及重现性 越好，但灵敏度较差。使用小内径色谱柱的 纳升色谱的灵敏度好，但操作难度较da， 色谱分析时间较长。
质谱监测是蛋白药物代谢定量分析的最后 一环，也是关键一环。目前通常采用两类质 谱进行此类分析：三重四极杆质谱与 四极杆 - 静电场轨道阱质谱（q - orbitrap）。 两种质谱分别使用选择反应监测质谱法 （select reaction monitor，srm）与平行反应 监测（parallel reaction monitoring，prm）质 谱法。三重四级杆质谱结构中串联了四极杆-碰撞池-四 极杆三个主要部件。在srm质谱方法中：众多 肽段经过色谱分离、离子化后，进入第一个 四极杆质量分析器中。在这里将只允许提前 设定的，接近指纹肽质量条件的离子通过，离子在通过后立即进入碰撞池并发生碎裂。 产生的碎片将进入后面的四极杆质量分析器， 只有符合预先设定的符合指纹肽碎裂特点的 碎片离子才能通过，并最终到达检测器产生 质谱信号。通过两次质量选择，指纹肽信号 被从复杂的基质中分检出来，其强度被用于 定量（图3）[5,7,8,9] 。
q-orbitrap型质谱结构与三重四级杆质谱的最主 要区别是，最后端的质量分析器改为静电场 轨道阱（orbitrap）。从信号扫描方式上看， 四极杆质谱在点时间上只能扫描一个信号值， 如果想扫描多个信号，就需要在不同的信号 域间不停地反复进行切换。而 orbitrap 则可对进入的所有离子同时进行高分辨、高准确检 测。这是其质谱方法被称为平行离子监测的 原因（图3）。三重四级杆进行srm的主要特点是可 进行超高频率的低分辨扫描；而q-orbitrap进 行的prm方法特点为可进行高准确、高分辨扫 描，但扫描频率一般。
amelia等详尽地对比了srm与prm的各项 性能[6] 。其中，在灵敏度、定量线性、重现性 等方面两者没有差别，但prm在选择准确性与 定量范围上优于srm，而srm在定量精度上有 优势。总体比较，而两者在定量能力上基本 一致。但如果从实验流程的角度看，基于qorbitrap的prm方法还具独特的优点：prm方 法开发简单、时间短。这是因为srm方法仅可 允许个别碎片离子进入检测器，为了得到好的效果，需要对所有候选的碎片进行选择 优化。而prm在检测中一次性记录了全部的碎 片离子，省略了挑选碎片离子的方法开发过 程[6] ，并同时实现了定性与定量。还特别需要 指出的是，q-orbitrap具有超高分辨优势，背 景基质越复杂，其抗噪音能力越强于三重四级杆质 谱[6] 。显而易见，因为当背景杂质复杂程度加 大时，近似内标肽段特性的干扰杂质将越多， 而三重四级杆质谱只具备单位分辨能力（约几百ppm 分辨能力），其对杂质的过滤作用就远不如 具有高分辨能力的orbitrap（小于5ppm分辨） 质量分析器。
此外，由于q-orbitrap为超高分辨串联质 谱，因此，除了可对特定多肽进行定量分析 外，对于完整蛋白分子量测定、肽图及修饰、 二硫键、寡糖及糖肽分析、宿主细胞残留蛋 白鉴定与定量等众多分析项目都是q-orbitrap 型质谱的分析强项。由于一台q-orbitrap具备全面且强大的分析性能，使其性价比远远优 于传统的使用q-tof与三重四级杆两台质谱来完成从 蛋白表征到定量工作的组合[6,10-15] 。
目前单抗类药物的给药量一般为 1- 10mg/kg，在血中的浓度从ug/ml到sub-ng/ml， 因此其期望定量限可到 sub-ng/ml 水 平 。 mireia等采用附着生物素及抗抗体磁珠的免疫 富集技术，使用微升液相与tsq vantage triple quadrupole 质谱联用 ， 实现了血清中 7.03 ng/ml到450 ng/ml的单抗的定量[7] . duan等使 用纳升液相与tsq quantum triple quadrupole 质谱联用，在血浆中实现了12.9 ng/ml至32.3 µg/ml的单抗定量范围[9] ，在不同组织中达到 了0.156 至 0.312 μg/g的单抗定量限[8] 。paul等 在血浆中使用q-exactive quadrupole orbitrap 质谱实现了cetuximab单抗在血浆中 从6.60 到 660 pmol/ml (19.8 to 1980 fmol on column)的 定量[11] 。gu等使用prm法测定大鼠血浆中人 重组干扰素含量的实验中，实现了sub-ng/ml 定量，定量范围达到6个数量级（图4）[15] 。 简要来说，使用q-orbitrap进行蛋白代谢 分析具有如下优点： • 高灵敏度 • 宽线性范围 • 抗基质噪音能力强 • 同时定性定量 • 方法设置简单 • 无需方法优化
质谱技术可有效地解决elisa方法做蛋白 药物代谢分析时遇到的自身抗体干扰、定量 范围窄、非特异性结合、交叉反应、以及免 疫原性影响等问题。而且，随着质谱技术的
不断发展，特别是以orbitrap为代表的，性能 高，稳定性好，操作简单的质谱的推广应用， 以及更高灵敏度的三重四极杆质谱的推出，加之纳升液相与免疫富集等方法的辅助，蛋 白药物代谢分析即将进入全新的技术时代。
更多信息请点击：四极杆 - 静电场轨道阱质谱（q - orbitrap）